果蠅的神經遞質系統與哺乳動物系統非常相似，它們有許多類似的大腦結構，涉及類似的行為，并且許多已知影響哺乳動物行為的基因在果蠅中存在并執行相同的功能。強迫游泳試驗（FST）已被廣泛用于評估化合物的抗抑郁功效，果蠅也嘗試采用這種試驗。蠅類強迫游泳試驗有可能成為評估潛在抗抑郁藥物的一種經濟高效、高通量的檢測方法。


強迫游泳測試（FST）是一種行為絕望范式，經常用于大鼠，以測量應對不可避免的逆境應對策略，其中被動應對策略（不動）被解釋為抑郁樣，而減少不動則作為抗抑郁藥樣的證據 效果。FST可用于篩選給予其他健康大鼠藥物的抗抑郁作用，用于抑郁癥動物模型中的被動應對策略，或用于研究抑郁癥的動物給予藥物的抗抑郁樣作用。

在這項研究中，我們使用與抗抑郁癥有關的methamphetamine（METH）、DL-α-methyltyrosine（αMT）、citalopram（CIT）以及psilocybin（PSI）、5-HT1A受體拮抗劑 WAY 100635（WAY）和5-HT2受體拮抗劑 Ketanserin（KET），對果蠅運動活動以及FST的影響進行了藥理評估。

方法
果蠅活動監測系統用于測量隨時間變化的運動活動。將雌雄蒼蠅分別放入透明的試管中，試管的一端塞有松散的棉花團，另一端裝有食物培養基和塑料蓋。食物培養基為vehicle、METH（5.0 mM）、αMT（3.0 mM）、CIT（0.3、1.0 或 2.5 mM）、PSI（0.03 mM、3.5 mM）、KET（1.0 mM）或 WAY（1.0 mM）。1×表示在分組條件下用處理食物喂養蒼蠅24小時，之后轉移到vehicle培養基的試管中，用vehicle培養基中的PSI（0.03 mM）喂養蒼蠅 1 天，然后用vehicle培養基喂養蒼蠅 4 天。5×表示蒼蠅在上述試管中連續喂食處理食物5天。將蒼蠅放入活動監測系統，每個處理組的雌雄蠅各為n= 16，并在恒定光照條件下飼養至少 5 天，同時進行監測。所有其他蒼蠅均在恒定光照條件下飼養 5 天，然后在 FST 中進行測試，每個處理組中雌雄各n= 7 只，FST 中的單個數據點代表 16 只蒼蠅的平均行為。如圖 1所示。

圖1

果蠅強迫游泳測試(FST)用于測量兩種實驗室6天齡雄性和雌性的不動行為。將一天齡（5×）或兩天齡（1×）的未被誘導的蒼蠅進行短暫麻醉，并分別放入塑料管中。然后將這些試管棉花狀放入200 mL移液器吸頭盒的支架中，并在恒定光照下放置至第5天。在4孔室載玻片上每孔放置一只果蠅，對蒼蠅的FST行為進行評估。使用頂置攝像頭記錄蒼蠅在孔中最初5分鐘的FST行為，以便隨后使用動物運動軌跡跟蹤系統分析SC不動的潛伏期、不動的時間和不動的次數。為了驗證蒼蠅是否具有活動能力，在錄制5分鐘視頻后，用工具將每只蒼蠅輕輕取出并放到紙巾上。任何不能立即離開的蒼蠅都被認為是淹死的，隨后被排除在最終分析之外。由于CS果蠅的不同亞品系已顯示出運動活動差異，因此在強迫游泳測試中比較了兩種 CS 亞品系（CSX和CSCLWU）。


結果
強迫游泳行為和整體運動活動因性別、劑量和給藥策略而異
在果蠅活動監測中分析發現，性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及性別引起的顯著變化和治療。飼喂vehicle培養基的CSX雌性和雄性比同性CSCLWU顯著更活躍（圖2A）。CSX和CSCLWU雄性的活躍程度顯著低于同品系雌性。PSI (0.03 mM) 增加了 CSX 雌性果蠅的運動活動，但不增加CSX雄性或 CSCLWU 果蠅的運動活動。

在FST中，對自變量性別（雄性、雌性）和品系（CSX、CSCLWU）進行雙向方差分析發現，性別和品系之間存在顯著的交互作用，以及性別引起的顯著變化和應變。雄性比雌性和CSX雄性更加不動，但雄性和雌性CSX果蠅之間沒有觀察到差異（圖2B）。CSX 雌性和雄性的不動次數明顯少于同性 CSCLWU（圖 2B）。

由于給予 0.03 PSI (1×) 的CSCLWU果蠅在FST中更加不動，并且沒有增加它們在果蠅活動監測系統中的整體運動活性，因此選擇該品系進行額外的實驗。此外，由于雄性CSCLWU果蠅明顯比雌性果蠅更不動，因此在隨后的FST分析中對性別進行了獨立評估。

圖2

強迫游泳中的靜止狀態與整體運動活動無關，CIT可以減少這種不動性
將FST行為與第五天在用vehicle或vehicle介質中的藥物喂養的果蠅活動監測系統中的整體運動活動進行比較（圖 1）。使用的藥物為 METH (5.0 mM)、αMT (3.0 mM) 和 CIT (0.3 mM、1.0 mM、2.5 mM)。

對自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle、METH）的雙向方差分析發現，性別和治療之間存在顯著的交互作用，以及由性別和治療引起的顯著變異。飼喂vehicle的雄性活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。METH顯著增加了雄性和雌性的運動活動（圖 3A）。

自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle，αMT）的雙向方差分析發現性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及性別和治療之間的顯著變化。飼喂vehicle的雄性的活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。αMT顯著降低雄性和雌性的運動活動（圖 3B）。

對自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle、0.3、1.0和2.5 mM CIT）的雙向方差分析發現性別和治療之間存在顯著的相互作用，以及兩種性別引入的顯著變異和治療。飼喂vehicle的雄性活性顯著低于飼喂vehicle的雌性。2.5 mM CIT 顯著降低雌性的運動活動，但各組之間沒有觀察到其他差異。（圖 3C）。

由于雄性在果蠅活動監測系統時活躍程度始終顯著較低（圖 2a、3a-c），因此使用單向方差分析獨立評估性別的FST行為。CIT顯著降低了雄性的不動性，增加了雌性和雄性的SC不動潛伏期，并減少了雄性的不動次數。與vehicle相比，METH或αMT的任何結果測量均未觀察到顯著差異（圖 4）。

圖3

圖4

對PSI的總體運動反應因性別、劑量和用藥策略而異
為了評估PSI對果蠅活動監測系統中整體運動活動的影響，給予PSI (0.03 mM、3.5 mM) (1x)。自變量性別（雄性、雌性）和藥物治療（vehicle，PSI 3.5 mM，PSI 0.03 mM）的雙向方差分析發現性別和治療之間存在顯著的相互作用（圖5A），并且因性別和治療造成顯著差異。對照雄性的活躍程度顯著低于雌性。PSI在3.5 mM時降低雌性的運動活性，但在3.5 mM和0.003 mM時增加雄性的運動活性。

慢性和低劑量PSI對整體運動活動的影響不同
為了評估PSI在果蠅運動監測中的結果是否是由于5-HT1A或5-HT2A血清素受體的作用所致，在PSI（0.03mM）、WAY（1.0mM）、KET（1.0mm）及vehicle上飼養蒼蠅5天（5×）。分析發現性別和藥物治療之間存在顯著的相互作用，以及由于性別和藥物治療而產生的顯著變化（圖5B）。對照組雄性的活躍程度顯著低于雌性。KET顯著降低雌性和雄性的運動活動。WAY 顯著降低了雄性的運動活動，但對雌性沒有影響。接受PSI的雌性和雄性明顯比接受 KET的同性更活躍。（圖 5B）。

圖5

PSI對強迫游泳中不動的影響與CIT相當
CIT 5× 能顯著降低雄性的不動性、SC不動性潛伏期和陣發性不動性，并能顯著降低雌性的SC不動性潛伏期和陣發性不動性。在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明顯降低雄性的不動性；在 3.5 mM和 0.03 mM下，PSI能明顯降低雄性第一次不動的潛伏期；在 3.5 mM和 0.03 mM濃度下，PSI能明顯降低雄性不動的陣發性。（圖6）。

圖6

討論
METH（圖3A）和αMT（圖3A）顯著改變雄性和雌性果蠅的運動活動，但很大程度上不影響FST行為（圖4）。相比之下，CIT (1.0 mM) 5×?不影響雄性或雌性果蠅的運動活動（圖 3C），但顯著降低雄性不動性、兩性的不動潛伏期和雄性不動性發作次數（圖 4）。因此，FST的運動活動與整體運動活動脫鉤，并受到 SSRI 抗抑郁藥物的選擇性調節（圖 4）。

高劑量和低劑量的PSI 1×?均顯著降低了FST中雄性的不動行為（圖 6），但也增加了果蠅活動監測中的整體運動活動。在FST的典型使用中，抗抑郁藥物選擇性地增加FST的活性，但不會增加整體運動活性。然而，在FST的典型使用中，所研究的藥物是在測試后24小時內服用的。在此實驗中，僅施用PSI一天，然后在測試前對果蠅施用vehicle 4天。與雌性和另一品系的雄性相比，CSCLWU雄性果蠅似乎特別不愛動（圖2），因此 DAMS 和 FST 中運動活動的增加可能表明功能的增強和隨后行為的正常化。支持這一假設的是，PSI（0.03 mM）5×以及 WAY 和 KET 5×降低了雄性 DAMS 的活動（圖5B）。 WAY 對 5-HT1A 受體的慢性拮抗作用和KET對 5-HT2 受體的慢性拮抗作用導致了與慢性PSI相似的行為結果。因此，觀察到的果蠅活動監測中活性降低可能是受體內化的結果。

參考文獻
Hibicke M, Nichols C D. Validation of the forced swim test in Drosophila, and its use to demonstrate psilocybin has long-lasting antidepressant-like effects in flies[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 10019.

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